Ambroxol hamuje agregację α-synukleiny w chorobie Parkinsona

Jak ambroxol zmienia podejście do leczenia Parkinsona?

Badacze odkryli nowy, potencjalnie ważny mechanizm działania ambroxolu (ABX) – leku obecnie testowanego w leczeniu choroby Parkinsona. Dotychczas znany przede wszystkim jako środek wykrztuśny, ABX zyskał uwagę neurologów dzięki zdolności do stabilizowania enzymu glukocerebrozydazy (GCase). Nowe badania ujawniają jednak, że lek może bezpośrednio hamować kluczowy proces w patogenezie choroby Parkinsona – koagregację α-synukleiny z lipidami.

Choroba Parkinsona, druga po chorobie Alzheimera najczęstsza choroba neurodegeneracyjna, charakteryzuje się utratą neuronów dopaminergicznych powodujących bradykinezję, drżenie i demencję. Istotnym markerem choroby są ciała Lewy’ego – białkowo-lipidowe inkluzje, których głównym składnikiem jest α-synukleina (αS).

Czy strukturalne zmiany α-synukleiny i mutacje GBA napędzają patogenezę Parkinsona?

α-Synukleina to niewielkie (14 kDa) wewnętrznie nieuporządkowane białko (IDP), występujące w mikromolarnych stężeniach w synapsach neuronalnych. W warunkach fizjologicznych uczestniczy w pączkowaniu i łączeniu pęcherzyków synaptycznych. Jednak w ciałach Lewy’ego białko to przyjmuje formę sztywnych włókien amyloidowych, gdzie monomery αS agregują poprzez układanie struktur β-kartki. Wiele czynników wpływa na skłonność αS do tworzenia włókien amyloidowych in vitro, takich jak pH, temperatura, jony metali i powierzchnie jak powietrze/woda, polistyren/woda, błona/woda czy interfejsy detergent/woda. “Interakcja między αS a błonami lipidowymi odgrywa podwójną, przeciwstawną rolę – jest kluczowa dla proponowanej funkcji biologicznej białka, tj. plastyczności synaptycznej, a jednocześnie niezbędna do zapoczątkowania tworzenia koagregatów lipidowo-białkowych” – piszą autorzy badania.

Szczególnie interesujący jest związek między chorobą Parkinsona a mutacjami genu GBA, kodującego enzym glukocerebrozydazę. Mutacje te stanowią najważniejszy genetyczny czynnik ryzyka rozwoju choroby Parkinsona i wiążą się ze zmianami poziomów i właściwości substratów GCase – glikozyloceramidu i glukozylosfingozyny, a szerzej sfingolipidów. Mutacje GBA prowadzą do zmniejszenia aktywności GCase i/lub poziomów białka, dysfunkcji lizosomalnej oraz zwiększonych poziomów lipidów i α-synukleiny w modelach komórkowych i zwierzęcych choroby Parkinsona oraz w próbkach pochodzących od pacjentów, w tym płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF), pośmiertnych próbkach mózgu i fibroblastach. Podobne obserwacje zanotowano, gdy aktywność GCase była zmniejszona po leczeniu małymi cząsteczkami inhibitorów, takimi jak Conduritol β Epoxide (CBE).

Jak ambroxol wpływa na funkcjonowanie enzymu GCase?

Ambroxol początkowo stosowany był w leczeniu nadmiernego wydzielania śluzu w drogach oddechowych u niemowląt, ale odkryto, że działa również jako chaperon molekularny dla GCase. ABX wiąże się z miejscem aktywnym GCase w siateczce śródplazmatycznej, stabilizując strukturę białka, a następnie odłącza się od niego, gdy kompleks ABX/GCase dociera do lizosomów, pozostawiając białko aktywne. Badania wykazały, że ABX przywraca spadek poziomów aktywności i białka GCase oraz odwraca wzrost poziomów lipidów i αS spowodowany mutacjami GBA w neuronach i fibroblastach PD, PD-GBA i/lub GD NCSC-DA. ABX prowadził również do zmniejszenia poziomów αS w komórkach SH-SY5Y i myszach z nadekspresją αS.

W omawianym badaniu naukowcy wykazali, że ABX bezpośrednio zapobiega tworzeniu koagregatów αS-DMPS i wypiera αS z błony. “Wykorzystując modelowanie kinetyczne chemiczne koagregacji lipidowo-białkowej wraz z danymi kinetycznymi agregacji mierzonymi dla różnych stosunków DMPS:αS:ABX, ujawniamy, że ABX hamuje etap pierwotnej nukleacji w szlaku koagregacji αS-DMPS” – wyjaśniają badacze. Zaobserwowali również, że efekt hamujący ABX jest specyficzny dla tej cząsteczki, ponieważ CBE nie wpływał ani na interakcje αS-błona, ani na koagregację DMPS-αS w włókna amyloidowe.

Jakie eksperymentalne dowody potwierdzają specyficzność działania ABX?

Aby zbadać wpływ ABX na agregację αS, inkubowano αS i modelowe błony DMPS w obecności lub bez różnych stężeń ABX w warunkach spoczynkowych przy pH 6,5 i 5,5 (zbliżonym do pH lizosomalnego) w temperaturze 30°C. Stosowano świeżo przygotowaną monomeryciną N-terminalnie acetylowaną αS, ponieważ N-terminalna acetylacja jest jedną z fizjologicznie istotnych modyfikacji potranslacyjnych tego białka.

Wyniki pokazały, że przy zwiększających się stężeniach ABX szybkość agregacji zmniejszała się, aż do całkowitego zahamowania przy stosunku ABX:αS wynoszącym 6:1 i stosunku ABX:DMPS wynoszącym 3:2. Badacze potwierdzili te obserwacje za pomocą mikroskopii elektronowej oraz pomiarów polaryzacji fluorescencji. Aby wykluczyć potencjalne efekty wygaszania fluorescencji ThT przez ABX, monitorowano również kinetykę agregacji αS (2% znakowanej Alexa 488 A140C αS) w obecności DMPS i ABX za pomocą pomiarów polaryzacji fluorescencji (fp).

Czy ABX oddziałuje na właściwości błon lipidowych?

Co ciekawe, efekt hamujący był specyficzny dla ABX – inny związek wpływający na aktywność GCase, Conduritol β Epoxide (CBE), nie miał wpływu na tworzenie koagregatów αS-DMPS przy żadnym z badanych pH. Ponadto ABX nie hamował agregacji αS niezależnej od lipidów, co sugeruje specyficzność dla procesu koagregacji αS-lipid. Badacze przeprowadzili testy agregacji w płytkach mikrostudzienkowych z polistyrenu, gdzie pierwszy krok agregacji αS zachodzi na interfejsie polistyren/woda, oraz badali wpływ ABX na etap elongacji tworzenia włókien niezależnych od lipidów, inkubując monomery αS z preformowanymi zarodkami włókien αS i ABX lub CBE. W żadnym z tych eksperymentów nie zaobserwowali zmian w szybkości agregacji.

Badacze wykorzystali spektroskopię dichroizmu kołowego (CD) oraz analizę dyspersji indukowanej przepływem (FIDA) do zbadania, czy ABX wpływa na wiązanie αS do błon DMPS. Wyniki wskazują, że ABX wypiera αS z błon DMPS poprzez mechanizm konkurencyjnego wiązania. “Model ilościowo dokładnie uchwytuje dane i, wykorzystując znaną powinowactwo i stechiometrię αS do błon DMPS, dał powinowactwo między DMPS a ABX wynoszące K_D = 86 ± 68 nM i stechiometrię 1,23 ± 0,06 cząsteczek DMPS na cząsteczkę ABX w kompleksie” – raportują naukowcy.

Jakie mechanizmy hamują tworzenie oligomerów α-synukleinowych?

Aby dalej zbadać interakcję między ABX a DMPS, przeprowadzono pomiary fp modelowych błon DMPS z fluoroforem 1,6-difenylo-1,3,5-heksatrien (DPH) i rosnącymi stężeniami ABX. Polaryzacja DPH zależy od płynności błony DMPS, ponieważ DPH jest zagłębiony w dwuwarstwie lipidowej. Wyniki wskazują, że ABX wiąże się do błony DMPS, a wiązanie ABX:DMPS prowadzi do topnienia błony, podobnie jak obserwowano dla αS i innych małych cząsteczek znanych z wypierania αS z błony.

Kluczowym elementem badania była analiza kinetyczna, która pozwoliła zidentyfikować dokładny mechanizm działania ABX. Badacze najpierw ustalili bazowy model kinetyczny dla nieinhibowanego systemu, monitorując dynamikę agregacji poprzez fluorescencję ThT w dwóch głównych seriach eksperymentalnych: (i) przy zmiennych początkowych stężeniach DMPS przy stałym stężeniu αS oraz (ii) przy zmiennych stężeniach αS przy ustalonych poziomach DMPS, każdy przeprowadzony przy pH 5,5 i 6,5.

Wykorzystując model kinetyczny uwzględniający dwuetapowy proces nukleacji (oligomeryzację i konwersję) oraz wzrost koagregatów, badacze wykazali, że ABX specyficznie hamuje etap tworzenia oligomerów. “Wczesne wykresy logarytmiczne masy agregatu w funkcji czasu przy pH 6,5 pokazują zmniejszenie efektywnego wykładnika skalowania z ~3 do ~2 wraz ze wzrostem stężenia ABX” – zauważają autorzy. Skalowanie t^3 jest typowo wskaźnikiem dwuetapowego procesu nukleacji z ograniczającym szybkość etapem konwersji oligomerów, podczas gdy skalowanie t^2 sugeruje, że proces konwersji oligomerów nie jest już ograniczający szybkość, a zatem proces tworzenia oligomerów staje się ograniczający szybkość. Przesunięcie w kierunku skalowania kwadratowego wskazuje, że obecność ABX spowalnia ogólną szybkość agregacji poprzez hamowanie tworzenia oligomerów.

Przy pH 5,5, gdzie k_c jest już wysokie i konwersja nie ogranicza szybkości, kinetyka wczesnego czasu pozostaje kwadratowa, co jest zgodne z obrazem, w którym ABX celuje w etap tworzenia oligomerów. Wyniki te są zgodne z mechanizmem, w którym ABX hamuje koagregację αS-DMPS w włókna amyloidowe poprzez zakłócanie tworzenia wczesnych jąder oligomerycznych.

Czy odkrycia laboratoryjne przełożą się na korzyści kliniczne?

Czy wyniki te mogą mieć implikacje kliniczne? Zdecydowanie tak. Ambroxol jest obiecującą cząsteczką w leczeniu choroby Parkinsona i obecnie znajduje się w 2 i 3 fazie badań klinicznych jako lek na chorobę Parkinsona związaną z mutacjami GBA, a także w badaniach klinicznych jako lek na otępienie z ciałami Lewy’ego (DLB).

Badanie to sugeruje, że ABX może zapobiegać agregacji αS w różnych synukleinopatiach, w tym chorobie Parkinsona, DLB i zaniku wieloukładowym, działając dwutorowo – jako chaperon stabilizujący GCase oraz jako bezpośredni inhibitor koagregacji αS z lipidami. Jakie wyzwania stoją przed klinicystami planującymi wykorzystanie tego mechanizmu w terapii? Kluczowe będzie ustalenie optymalnych dawek leku zapewniających odpowiednie stężenie w tkance nerwowej oraz określenie, którzy pacjenci mogą odnieść największe korzyści z takiej terapii.

Jak ambroxol poszerza możliwości leczenia neurodegeneracji?

Warto zauważyć, że w badaniu wykorzystano N-terminalnie acetylowaną αS, ponieważ ta PTM występuje w fizjologicznej formie białka. Inne PTM zostały zgłoszone dla αS in vivo, niektóre z nich wpływają na interakcje białko-błona. Aby uzyskać głębsze zrozumienie wpływu ABX in vivo na wiązanie αS-błona i koagregację αS-lipid w włókna amyloidowe, konieczne byłoby rozszerzenie badania na αS z innymi fizjologicznie istotnymi PTM.

Dla praktyki klinicznej oznacza to, że ambroxol może oferować więcej korzyści terapeutycznych niż początkowo sądzono, szczególnie u pacjentów z mutacjami GBA. Badania te otwierają również nowe możliwości dla projektowania leków ukierunkowanych na wczesne etapy patogenezy chorób neurodegeneracyjnych.

Podsumowanie

Ambroxol, dotychczas znany głównie jako lek wykrztuśny, zyskuje nowe znaczenie w leczeniu choroby Parkinsona dzięki odkryciu dodatkowego mechanizmu działania. Oprócz funkcji chaperonu molekularnego stabilizującego enzym glukocerebrozydazę, ambroxol bezpośrednio hamuje koagregację α-synukleiny z lipidami – kluczowy proces w patogenezie choroby Parkinsona. Badania wykazały, że lek wypiera α-synukleinę z błon lipidowych poprzez konkurencyjne wiązanie i specyficznie hamuje etap tworzenia oligomerów, który inicjuje agregację białka w ciała Lewy’ego. Efekt ten jest specyficzny dla ambroxolu i nie występuje przy stosowaniu innych związków wpływających na aktywność glukocerebrozydazy, takich jak Conduritol β Epoxide. Szczególne znaczenie ma działanie ambroxolu w kontekście mutacji genu GBA, stanowiących najważniejszy genetyczny czynnik ryzyka rozwoju choroby Parkinsona. Lek działa dwutorowo, przywracając aktywność enzymu i jednocześnie zapobiegając patologicznej agregacji białka. Ambroxol znajduje się obecnie w drugiej i trzeciej fazie badań klinicznych jako potencjalny lek na chorobę Parkinsona związaną z mutacjami GBA oraz otępienie z ciałami Lewy’ego. Odkrycie to otwiera nowe możliwości terapeutyczne w leczeniu synukleinopatii i może przyczynić się do opracowania strategii ukierunkowanych na wczesne etapy patogenezy chorób neurodegeneracyjnych.