Ambroxol jako nowa nadzieja w terapii szpiczaka mnogiego

Czy ambroxol może przedefiniować leczenie szpiczaka?

Ambroxol, powszechnie stosowany lek mukolityczny, wykazuje obiecujące działanie przeciwnowotworowe w szpiczaku mnogim (MM) poprzez hamowanie autofagii. Pomimo rozwoju nowych terapii przeciwszpiczakowych w ostatniej dekadzie, które znacząco poprawiły rokowanie, większość pacjentów doświadcza nawrotów choroby, co podkreśla potrzebę poszukiwania nowych opcji terapeutycznych.

Autofagia stanowi kluczowy mechanizm przetrwania komórkowego, umożliwiający trawienie zdegradowanych białek i organelli. Komórki szpiczaka mnogiego wykorzystują cząsteczkę nośnikową p62/SQSTM1 do kierowania nieprawidłowo sfałdowanych białek do autofagosomów, które następnie łączą się z lizosomami, tworząc autolizosomy dokonujące ostatecznego trawienia niechcianych białek. Badania wykazały, że komórki plazmatyczne pozbawione genu ATG5 (autophagy-related gene 5) wykazują krótszy czas przeżycia w szpiku kostnym myszy w porównaniu z komórkami z dzikim typem ATG, co sugeruje, że autofagia jest niezbędna dla długoterminowego przeżycia komórek plazmatycznych. Mimo że inhibitory proteasomu są szeroko stosowane jako leki przeciwszpiczakowe, autofagia jako cel terapeutyczny nie została dotychczas w pełni wykorzystana. Warto wspomnieć o hydroksychlorochinie, inhibitorze autofagii, który był stosowany w badaniach klinicznych w terapii szpiczaka jako pojedynczy lek lub w połączeniu z bortezomibem, jednak kombinacja ta wykazywała ograniczoną skuteczność i znaczącą toksyczność.

Jak ambroxol wpływa na autofagię komórek szpiczaka?

W prezentowanym badaniu zastosowano podejście drug repositioning i odkryto, że ambroxol skutecznie zabija komórki szpiczaka poprzez hamowanie autofagii. Badanie wykazało, że ambroxol hamuje wzrost wszystkich linii komórkowych MM oraz próbek szpiku kostnego pobranych od pacjentów ze szpiczakiem mnogim, niezależnie od obecności zmian cytogenetycznych wysokiego ryzyka. Cytometria przepływowa ujawniła zwiększoną liczbę komórek wykazujących ekspresję Annexin V, a analiza western blot wykazała podwyższone poziomy ekspresji aktywowanych kaspaz-3 i kaspaz-9, co wskazuje na indukcję apoptozy przez ambroxol.

Aby ocenić wpływ ambroxolu na autofagię, przeprowadzono testy przepływu (flux assay), które wykazały, że ekspresja LC3-II, składnika błony autofagosomu, wzrosła po leczeniu ambroxolem linii komórkowych MM KMS21 i KMS34. Analiza western blot wykazała również wzrost ekspresji p62/SQSTM1 po leczeniu ambroxolem, co sugeruje, że ambroxol może hamować autofagię w późnym stadium. Testy turnover potwierdziły, że poziom LC3-II był dodatkowo zwiększony, gdy linie komórkowe MM były traktowane ambroxolem w połączeniu z resweratrolem (induktorem autofagii) w porównaniu z samym ambroxolem. Natomiast jednoczesne leczenie ambroxolem i bafilomycyną nie zmieniło znacząco poziomu LC3-II w porównaniu z samym ambroxolem. Wyniki te wskazują, że ambroxol hamuje autofagię w późnym stadium.

Dodatkowe potwierdzenie działania hamującego ambroxolu na autofagię uzyskano poprzez analizę reporter assay. Geny GFP-dzikiego typu LC3 i RFP-zmutowanego LC3 zostały jednocześnie wprowadzone do komórek KMS34. Gdy autofagia była indukowana przez resweratrol, GFP-dziki typ LC3 ulegał trawieniu, a fluorescencja RFP stawała się dominująca. Jednak gdy komórki były jednocześnie traktowane ambroxolem i resweratrolem, wykazywały współoświetlenie GFP i RFP, co potwierdza, że ambroxol hamuje autofagię indukowaną przez resweratrol.

Obserwacje mikroskopowe z użyciem transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) wykazały, że obszary wakuoli autofagicznych zwiększały się w czasie pod wpływem leczenia ambroxolem i były znacznie większe niż w grupie kontrolnej, co jest zgodne z wynikami testów turnover i reporter assay, sugerując, że ambroxol hamuje późne stadium autofagii komórek MM.

Czy ambroxol współgra z obecnymi terapiami szpiczaka?

Następnie oceniono wpływ na autofagię trzech dostępnych komercyjnie leków przeciwszpiczakowych: bortezomibu, lenalidomidu i panobinostatu. Leczenie komórek KMS34 bortezomibem zwiększyło ekspresję zarówno LC3-II, jak i p62, co sugeruje, że bortezomib prawdopodobnie hamuje późne stadium autofagii. Lenalidomid nie indukował znaczących zmian w poziomach LC3-II lub p62, co wskazuje na minimalny wpływ na autofagię. Z kolei panobinostat, inhibitor deacetylazy histonowej (HDAC), zwiększał poziomy LC3-II przy jednoczesnym zmniejszeniu ekspresji p62, co sugeruje, że panobinostat indukuje autofagię.

Ocena kombinacji przeciwszpiczakowych efektów ambroxolu z innymi lekami przeciwszpiczakowymi wykazała, że ambroxol nie wykazuje synergizmu z bortezomibem ani lenalidomidem. Jednak wartości indeksu kombinacji (CI) dla ambroxolu i panobinostatu były <1 w obszarach wysokiego stężenia w obu liniach komórkowych KMS21 i KMS34, co sugeruje synergistyczne działanie tych dwóch leków. Inhibitory HDAC indukują autofagię, która może promować przeżycie komórek i oporność na leki w komórkach nowotworowych. W przeprowadzonych eksperymentach przeciwszpiczakowy efekt panobinostatu został wzmocniony, gdy późne stadium autofagii zostało zahamowane przez jednoczesne leczenie ambroxolem.

Aby ocenić, czy ambroxol wykazywałby działanie przeciwnowotworowe w znacznie niższych (tj. farmakologicznie osiągalnych) stężeniach, przeprowadzono leczenie skojarzone z panobinostatem i niższymi stężeniami ambroxolu. Abx0.5 (stężenia ambroxolu wymagane do 50% hamowania wzrostu) komórek szpiczaka KMS21 i KMS34 wynosiły odpowiednio 8,6 i 12,2 μM w obecności 3 i 6 nM panobinostatu. Leczenie potrójne ambroxolem + panobinostatem + bortezomibem dawało wartości Abx0.5 wynoszące 0,24 μM dla KMS21 i 3,59 μM dla KMS34.

Aby odkryć mechanizm molekularny wyjaśniający, dlaczego ambroxol wykazywał synergizm z panobinostatem, ale nie z bortezomibem, oceniono ekspresję antyapoptotycznej cząsteczki MCL-1, która ulega degradacji przez proteasomy. Bortezomib nie zmniejszył ekspresji białka MCL-1 w komórkach KMS21, a nawet zwiększył ją w komórkach KMS34, co prawdopodobnie wynika z zahamowania degradacji proteasomalnej. Mechanizm ten może wyjaśniać, dlaczego ambroxol nie wykazywał synergistycznych efektów z bortezomibem w komórkach MM. Natomiast ekspresja białka MCL-1 była znacznie zmniejszona przez jednoczesne leczenie ambroxolem i panobinostatem w komórkach MM.

Jak ambroxol sprawdza się w modelach in vivo?

Przeprowadzono eksperymenty w celu potwierdzenia poziomów aktywności kaspaz indukowanych przez te terapie. Jednoczesne leczenie ambroxolem i panobinostatem wyraźnie zwiększyło poziomy aktywowanych kaspaz 3 i 9 w porównaniu z ambroxolem i bortezomibem. Ponadto leczenie samym ambroxolem zwiększyło ekspresję SIRT2, deacetylazy histonowej klasy III, podczas gdy leczenie samym panobinostatem ją zmniejszyło. Jednoczesne leczenie ambroxolem i panobinostatem częściowo przywróciło poziom SIRT2 obniżony przez panobinostat. Wynik ten może wyjaśniać, dlaczego ambroxol łagodził toksyczność żołądkowo-jelitową wywołaną przez panobinostat.

Odnośnie bezpieczeństwa, biegunka była często obserwowana u myszy leczonych panobinostatem. Częstość występowania biegunki była znacznie zmniejszona przez jednoczesne leczenie ambroxolem w porównaniu z samym panobinostatem. Myszy leczone panobinostatem ważyły mniej niż myszy w każdej innej grupie. Jednak jednoczesne leczenie panobinostatem z ambroxolem złagodziło utratę masy ciała.

Badanie histopatologiczne barwienia hematoksyliną i eozyną ujawniło, że liczba apoptotycznych komórek nowotworowych, charakteryzujących się agregacją chromatyny w jądrach, była większa w ksenoprzeszczepach leczonych ambroxolem w porównaniu z guzami kontrolnymi. W badaniu immunohistopatologicznym liczba komórek nowotworowych pozytywnych dla aktywowanej kaspazy-3 i PARP+ znacznie wzrosła w guzach leczonych ambroxolem. Ekspresja LC3 również zwiększyła się w ksenoprzeszczepach leczonych ambroxolem, podczas gdy barwienie P62 osłabło w guzach leczonych panobinostatem. Jednak leczenie skojarzone ambroxolem i panobinostatem reaktywowało barwienie p62. Barwienie LC3B zwiększyło się we wszystkich guzach leczonych lekami. Te wyniki in vivo potwierdzają obserwację in vitro, że ambroxol indukuje apoptozę i hamowanie autofagii.

Jak ambroxol indukuje apoptozę? (Mechanizmy molekularne)

Nie jest jasne, w jaki sposób ambroxol indukuje apoptozę komórek szpiczaka po zahamowaniu autofagii. Komórki szpiczaka produkują duże ilości białka M i uważa się, że znajdują się w stanie proteotoksycznym. Spekuluje się, że odpowiedź na nieprawidłowo sfałdowane białka (UPR) odgrywa rolę w przeżyciu komórek szpiczaka. Zaburzenie UPR przez hamowanie autofagii z użyciem ambroxolu może powodować śmierć komórek szpiczaka. Badania wykazały, że eIF2α i fosforylowany eIF2⍺ były słabo regulowane w górę przez leczenie ambroxolem oraz że ekspresja CHOP, induktora apoptozy, była następnie podwyższona. Jednak poziom XBP1s spadł po leczeniu ambroxolem. Inni autorzy spekulowali, że przeżycie komórek szpiczaka zależy od ekspresji XBP1s. W przeprowadzonych eksperymentach poziomy fosforylowanego eIF2⍺ i ekspresji CHOP zostały zmniejszone przez dodanie GSK2606414, inhibitora PERK, w obecności ambroxolu. Leczenie GSK2606414 przywróciło również żywotność komórek szpiczaka leczonych ambroxolem. STF083010, inhibitor szlaku IRE-1/XBP1, zmniejszył ekspresję XBP1s i dodatkowo promował śmierć komórek szpiczaka leczonych ambroxolem. Wyniki te sugerują, że ambroxol indukował ekspresję CHOP i apoptozę poprzez regulację w dół XBP1s i późniejszą aktywację szlaku PERK-eIF2⍺.

Aby wyjaśnić zmiany molekularne indukowane przez leczenie ambroxolem, przeprowadzono analizę GSEA między komórkami szpiczaka mnogiego leczonymi i nieleczonymi ambroxolem. Zestawy genów “GOBP_NEGATIVE_REGULATION_OF_AUTOPHAGY”, “GOCC_AUTOPHAGOSOME” i “GOBP_AUTOPHAGOSOME_ORGANIZATION” uległy zwiększonej ekspresji. Wśród genów o znacząco zmienionej ekspresji po leczeniu ambroxolem znalazły się SIRT2 i FOXK1 (forkhead box K1), które jak donoszono, hamują późne stadium autofagii poprzez hamowanie fuzji autofagosomu z lizosomami. Wzrost ekspresji produktów genów SIRT2 i FOXK1 po leczeniu ambroxolem potwierdzono za pomocą western blot w komórkach KMS21 i KMS34. Analiza szlaków wykazała również, że szlaki dla “Autophagy”, “UPR” i “Sirtuin” zostały znacząco zmienione przez leczenie ambroxolem w komórkach MM.

Autofagia jest niezbędnym systemem komórkowym dla przeżycia normalnych i nowotworowych komórek. Jednak nadmierna indukcja autofagii powoduje śmierć komórek nowotworowych. Na przykład w nowotworach hematologicznych trójtlenek arsenu (As₂O₃), deksametazon i idarubicyna indukują autofagię i następującą po niej autofagiczną śmierć komórek. Z drugiej strony, indukcja autofagii przez leki przeciwnowotworowe czasami osłabia aktywność przeciwnowotworową i powoduje oporność na leki. Dlatego łączenie leków przeciwnowotworowych z inhibitorami autofagii może potęgować aktywność przeciwnowotworową.

Jakie wyzwania kliniczne związane są z ambroxolem?

W badaniu klinicznym fazy 1 hydroksychlorochiny z bortezomibem u pacjentów z opornym MM, odsetek bardzo dobrej częściowej odpowiedzi wynosił tylko 14%, a trombocytopenia i toksyczność żołądkowo-jelitowa stopnia 3 lub wyższego były obserwowane odpowiednio u 28% i 24% pacjentów. Na podstawie przedstawionych danych, bortezomib nie zawsze wykazuje efekt synergistyczny z inhibitorami autofagii. Ponadto potrzebne są leki mniej toksyczne niż hydroksychlorochina.

Panobinostat nie jest lekiem pierwszego wyboru w nieleczonym MM. Jednak autorzy proponują, aby rozważyć terapię skojarzoną panobinostatem i ambroxolem jako nową opcję terapii ratunkowej w przypadkach podwójnie opornych (na leki immunomodulujące i inhibitory proteasomu) lub w leczeniu podtrzymującym bez leków immunomodulujących. W ostatnim czasie inhibitory HDAC są stosowane w nowotworach z komórek T. Terapia skojarzona z ambroxolem może również pomóc w przezwyciężeniu oporności na leki i działań niepożądanych inhibitorów HDAC w chorobach komórek T.

Dla przyszłego zastosowania klinicznego ważne jest rozważenie kilku ograniczeń tego badania. Po pierwsze, do zahamowania wzrostu komórek MM wymagana była bardzo wysoka dawka ambroxolu, co rodzi pytanie, czy ambroxol hamowałby wzrost komórek MM przy znacznie niższych stężeniach. Jednak ambroxol w stężeniach kilku mikromolarnych lub niższych hamował wzrost komórek MM w połączeniu z panobinostatem lub bortezomibem. Ponadto iniekcja dożylna może dawać znacznie wyższe maksymalne stężenie w osoczu (Cmax) i wartości pola pod krzywą niż dawka doustna i poprawiać skuteczność kliniczną. Na przykład Wang i wsp. donieśli o okołooperacyjnej ochronie płuc przez wysoką dawkę iniekcji ambroxolu u pacjentów z rakiem płuc. Ostatnio bardzo wysokie dawki doustnego ambroxolu (do 1485 mg/dzień lub 25 mg/kg/dzień) podawano pacjentom z chorobą Gauchera i zgłaszano, że są ogólnie bezpieczne. Dzięki tym podejściom (wysokodawkowe podawanie doustne lub iniekcja dożylna w terapii skojarzonej) oczekuje się, że ambroxol wykaże aktywność przeciwnowotworową w warunkach klinicznym.

Jednym z głównych działań niepożądanych panobinostatu jest biegunka. Zgłaszano, że knockdown HDAC powoduje zatrzymanie wzrostu, różnicowanie i apoptozę mysich komórek nabłonkowych jelit. Uważa się również, że hamowanie HDAC przez panobinostat powoduje toksyczność żołądkowo-jelitową. Badanie transkryptomu komórek leczonych ambroxolem wykazało ekspresję SIRT2, deacetylazy histonowej klasy III, która może kompensować hamowanie HDAC przez panobinostat, potencjalnie prowadząc do złagodzenia biegunki u myszy leczonych panobinostatem. Zgłaszano również, że okołooperacyjna wysoka dawka ambroxolu łagodziła pooperacyjne powikłania płucne i zmniejszała zależność od antybiotyków u pacjentów z rakiem płuc. Ambroxol może również mieć działanie przeciwutleniające lub przeciwzapalne.

Innym klinicznym ograniczeniem tego badania jest to, że tak wysoka dawka ambroxolu może indukować toksyczność hematologiczną lub inne toksyczności, mimo że nie zaobserwowano znaczącej utraty masy ciała w modelu mysim. Szczegóły skuteczności klinicznej, toksyczności i farmakokinetyki wysokiej dawki ambroxolu wymagają zbadania w przyszłych badaniach klinicznych.

Chociaż ambroxol był stosowany jako lek mukolityczny, wykazuje nie tylko hamowanie autofagii, ale także wzmocnienie przeciwnowotworowej odporności poprzez osłabienie α-2,3-sjalilacji jako efekt poza celem. Zhang i wsp. donieśli, że ambroxol wzmacniał przeciwnowotworowy efekt paklitakselu przeciwko komórkom raka płuc poprzez hamowanie autofagii, mimo że sam ambroxol nie wykazywał znaczącej regresji guza. Nie wywnioskowano mechanizmów molekularnych synergizmu ambroxolu z paklitakselem, ale spekulowano, że alkalizacja lizosomalna była przyczyną hamowania autofagii. Jednak w przedstawionym badaniu nie zaobserwowano alkalizacji lizosomalnej przez barwienie lizosomu oranżem akrydyny i nie zaobserwowano inaktywacji katepsyny D, głównej proteazy lizosomalnej. Wyniki sugerują, że ambroxol może regulować późne stadium autofagii w komórkach MM, prawdopodobnie poprzez hamowanie fuzji autofagosomu z lizosomem, a nie przez hamowanie funkcji lizosomalnej. Badania transkryptomu wykazały również, że ambroxol zmieniał ekspresję genów związanych z autofagią i sugerowały SIRT2 i FOXK1 jako przypuszczalne cząsteczki zaangażowane w indukowane przez ambroxol hamowanie autofagii.

Podsumowując, badanie wykazało, że ambroxol skutecznie zabija komórki szpiczaka mnogiego poprzez hamowanie autofagii w późnym stadium. Połączenie ambroxolu z panobinostatem wykazuje synergistyczne działanie przeciwnowotworowe zarówno in vitro, jak i in vivo, przy jednoczesnym zmniejszeniu toksyczności panobinostatu. Hamowanie autofagii w połączeniu z istniejącymi lekami może stanowić nowe podejście terapeutyczne w leczeniu szpiczaka mnogiego, szczególnie u pacjentów z opornością na standardowe terapie.

Podsumowanie

Badania wykazały, że ambroxol skutecznie eliminuje komórki szpiczaka mnogiego poprzez hamowanie procesu autofagii w późnym stadium. Lek działa na wszystkie linie komórkowe MM, niezależnie od obecności zmian cytogenetycznych wysokiego ryzyka. Szczególnie obiecujące wyniki uzyskano w kombinacji z panobinostatem, gdzie zaobserwowano synergistyczne działanie przeciwnowotworowe zarówno in vitro, jak i in vivo. Co istotne, ambroxol zmniejszał również toksyczność żołądkowo-jelitową związaną z panobinostatem. Mechanizm działania ambroxolu opiera się na regulacji ekspresji genów SIRT2 i FOXK1, które hamują fuzję autofagosomu z lizosomami. Głównym wyzwaniem w zastosowaniu klinicznym pozostaje konieczność stosowania wysokich dawek leku, jednak badania wskazują na możliwość skutecznego działania przy niższych stężeniach w terapii skojarzonej. To odkrycie może stanowić przełom w leczeniu pacjentów z opornością na standardowe terapie przeciwszpiczakowe.