Ambroxol jako nowa nadzieja w terapii chorób neurodegeneracyjnych

Jak neuroinflammacja i LPS wpływają na neurodegenerację?

Neuroinflammacja stanowi istotny proces zapalny przyczyniający się do zaburzeń poznawczych i chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera (AD) oraz choroba Parkinsona (PD). Komórki glejowe, szczególnie mikroglej i astrocyty, jako rezydentne makrofagi ośrodkowego układu nerwowego (OUN), odgrywają główną rolę w inicjowaniu i przetwarzaniu neuroinflammacji. Mimo że ostra neuroinflammacja pełni funkcję ochronną, przewlekła może zaburzać homeostazę OUN, potencjalnie prowadząc do neurodegeneracji. W warunkach fizjologicznych mikroglej odpowiada za eliminację szkodliwych substancji metabolicznych i toksycznych, jednak w warunkach stresu może ulegać aktywacji, migrować do miejsca uszkodzenia i usuwać niepożądane resztki komórkowe. Nadmierna i długotrwała aktywacja mikrogleju prowadzi do toksyczności neuronalnej i wzrostu poziomów cytokin prozapalnych zarówno w korze mózgowej, jak i hipokampie. Różne badania wykazały, że beta-amyloid (Aβ) aktywuje mikroglej i indukuje syntezę oraz uwalnianie wolnych rodników, cytokin prozapalnych i chemokin, takich jak tlenek azotu, TNF-α i IL-1β, które są charakterystyczne dla AD i PD. Mózg zawiera wysoką zawartość lipidów i jest bardziej podatny na stres oksydacyjny. Ze względu na wysoką zawartość lipidów, intensywna neuroinflammacja indukuje mitochondrialny stres oksydacyjny i zwiększone poziomy reaktywnych form tlenu, a także peroksydację lipidów na poziomie mózgu, prowadząc do zaburzeń neurodegeneracyjnych.

Lipopolisacharyd (LPS) jest integralnym składnikiem endotoksyny bakterii Gram-ujemnych i uznawany jest za ligand receptora Toll-podobnego 4 (TLR4). TLR4 należy do grupy receptorów rozpoznających wzorce (PRR), wykrywających wzorce molekularne związane z patogenami (PAMPs) lub uszkodzeniami (DAMPs). W OUN receptor TLR4 jest eksponowany na powierzchni mikrogleju, a po aktywacji odpowiada za produkcję cytokin prozapalnych, takich jak czynnik martwicy nowotworu alfa (TNF-α), interleukina 1 beta (IL-1β) i tlenek azotu (NO), które są kluczowymi regulatorami procesu neuroinflammacji. Podanie LPS gryzoniom wywołuje zaburzenia poznawcze i zmienia różnorodne zachowania, w tym anoreksję, zmniejszoną lokomocję, utratę masy ciała, zachowania eksploracyjne, zwiększony niepokój, senność i ogólną depresję behawioralną – objawy przypominające klinicznie istotne symptomy chorób neurodegeneracyjnych u ludzi. Ponieważ LPS bezpośrednio przyłącza się do receptora TLR4 i odpowiada za przetwarzanie zdarzeń zapalnych poprzez grupę białek aktywowanych mitogenami, takich jak kinaza N-końcowa c-Jun (JNK) i czynnik jądrowy kappa B (NFkB), uruchamia swoje szlaki sygnałowe downstream. Ta unikalna cecha LPS wzbudziła zainteresowanie i uznano go za najbardziej odpowiedni model dla neuroinflammacji mediowanej przez komórki glejowe, stresu oksydacyjnego i patologii podobnej do neurodegeneracji.

Czy ambroxol to kluczowy element terapii neurodegeneracji?

Naturalne, syntetyczne i półsyntetyczne substancje bioaktywne są stosowane w celu zmniejszenia zachorowalności i śmiertelności związanej z neurodegeneracją. Substancje te mogą pochodzić z roślin lub być izolowane z mikro- i makroorganizmów. Wśród nich źródła roślinne zyskały znaczne zainteresowanie w zapobieganiu i leczeniu patologii podobnych do AD i PD. Ambroxol (chlorowodorek 2-amino-3,5-dibromo-N-metylobenzyloaminy) to naturalny alkaloid stosowany głównie jako środek mukolityczny dla pacjentów z astmą. Poza właściwościami mukolitycznymi posiada również właściwości znieczulające, przeciwzapalne i antyoksydacyjne. Hamuje aktywację mikrogleju i zmniejsza akumulację cytokin prozapalnych. Według literatury, ambroxol jest repozycjonowany w kierunku leczenia chorób takich jak PD, choroba Gauchera, otępienie w przebiegu PD i otępienie z ciałami Lewy’ego, ponieważ obniża poziom α-synukleiny u ludzi i w modelach zwierzęcych oraz zwiększa aktywność glukocerebrozydazy (GCase). Badania wskazują również, że ambroxol może łagodzić objętość ostrego i przewlekłego udaru niedokrwiennego poprzez hamowanie procesów zapalnych. W związku z tym sugerujemy, że dootrzewnowe (IP) podawanie ambroxolu może łagodzić neurodegenerację indukowaną przez LPS, mediowaną przez neuroinflammację i mitochondrialny stres oksydacyjny.

W prezentowanym badaniu wykazano, że ambroxol reguluje ekspresję TLR4, komórek glejowych i ich celów downstream. Wcześniejsze badania wykazały zwiększoną ekspresję TLR4 pod wpływem LPS, co prowadzi do aktywacji astrocytów i mikrogleju. Analizując wpływ LPS na TLR4 i jego downstream markery zapalne w korze mózgowej i hipokampie myszy, przeprowadzono Western blotting dla TLR4, Iba-1, GFAP, p-NFkB i p-JNK. Wyniki wskazują na zwiększoną ekspresję wymienionych biomarkerów zapalnych po podaniu LPS, która została znacząco obniżona w grupie współleczonej LPS+Amb. Korzystne efekty potwierdzono mikroskopią fluorescencyjną przy użyciu przeciwciała GFAP, wykazując podwyższoną immunoreaktywność w regionach korowych i hipokampa w grupach traktowanych LPS, która została znacząco złagodzona w grupie LPS+Amb. Zarówno wyniki Western blot, jak i immunofluorescencji sugerują, że ambroxol może hamować regulację w górę TLR4 i p-NFkB, co może wspomagać neuroprotekcyjne mechanizmy ambroxolu.

Aktywacja komórek glejowych prowadzi do syntezy i wydzielania TNF-α i IL-1β, które uczestniczą w chorobach zapalnych. Badania Western blot i immunofluorescencji wykazały, że poziomy TNF-α i IL-1β były podwyższone w grupie poddanej działaniu wyłącznie LPS, natomiast ten podwyższony poziom został znacząco obniżony w grupie współleczonej LPS+Amb. Dodatkowo, immunofluorescencja tkanek mózgowych różnych grup zwierząt eksperymentalnych wykazała wysoką reaktywność TNF-α w grupie traktowanej LPS w porównaniu z grupą kontrolną, podczas gdy grupa leczona LPS+Amb wykazała mniejszą immunoreaktywność.

Neuroinflammacja prowadzi do podwyższonego stresu oksydacyjnego i obniża poziom białek antyoksydacyjnych (NRF2 i HO-1). Aktywność antyoksydacyjna dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) w tkankach korowych i hipokampa była znacząco zmniejszona po wstrzyknięciu LPS, a ambroxol znacząco łagodził to zmniejszenie. Ponadto, komórki doświadczają silnego stresu, gdy peroksydacja fosfolipidów prowadzi do produkcji malondialdehydu (MDA). Poziomy MDA były znacząco podwyższone w grupie LPS w porównaniu z grupą kontrolną, a potencjał łagodzący ambroxolu był dalej wspierany przez znaczącą redukcję poziomów MDA, podkreślając jego efektywną rolę w łagodzeniu stresu oksydacyjnego.

Jak ambroxol poprawia funkcje synaptyczne i pamięć?

Oceniono również stężenia czynnika jądrowego związanego z erytroidem 2 (NRF2) i jego późniejszego enzymu antyoksydacyjnego, oksygenazy-1 (HO-1), w tkankach korowych i hipokampa myszy. Wyniki Western blot wykazały zmniejszoną ekspresję NRF2 i HO-1 u myszy poddanych działaniu LPS w porównaniu z normalnymi kontrolami, podczas gdy ambroxol łagodził ekspresję NRF2 i HO-1 spowodowaną przez LPS w tkance mózgowej myszy współleczonych LPS-Amb. Wyniki te pokazują, że ambroxol łagodził poziom stresu oksydacyjnego poprzez regulację poziomu ekspresji NRF2 i HO-1 w tkankach korowych i hipokampa indukowanych podaniem LPS. Dodatkowo, w celu wzmocnienia wyników Western blot, przeprowadzono analizę immunofluorescencji, która potwierdziła, że myszy poddane działaniu LPS wykazywały zmniejszoną immunoreaktywność NRF2, podczas gdy grupa współleczona LPS+Amb znacząco odwróciła te efekty i zwiększyła reaktywność immunofluorescencji NRF2 w korze i hipokampie, sugerując jego potencjał antyoksydacyjny.

Neuroinflammacja indukowana LPS i podwyższony stres oksydacyjny łącznie prowadzą do toksyczności neuronalnej i dysfunkcji synaptycznej. W celu pomiaru integralności synaps zmierzono poziom zarówno pre, jak i postsynaptycznych biomarkerów, takich jak SNAP-23 i PSD-95. Wyniki Western blot wykazały zmniejszenie ekspresji SNAP-23 i PSD-95 w grupie traktowanej LPS w porównaniu z grupą poddaną działaniu normalnej soli fizjologicznej. Co istotne, ekspresja tych biomarkerów synaptycznych była zwiększona w grupie współleczonej LPS+Amb. Efekty te potwierdzono immunofluorescencją PSD-95 w korze i hipokampie różnych grup myszy. Wyniki sugerują, że ekspresja PSD-95 była zmniejszona w mózgach myszy traktowanych LPS w porównaniu z grupą kontrolną, natomiast immunofluorescencja PSD-95 była znacząco zwiększona w grupie współleczonej LPS+Amb.

W celu zbadania wpływu ambroxolu na dysfunkcje uczenia się i pamięci u myszy poddanych działaniu LPS, przeprowadzono testy labiryntu Y i labiryntu wodnego Morrisa (MWM). Test labiryntu Y wykazał, że LPS prowadzi do upośledzenia krótkotrwałej pamięci przestrzennej. Co ciekawe, leczenie ambroxolem zwiększyło procent spontanicznego zachowania alternatywnego, co poprawiło funkcję pamięci roboczej przestrzennej. W MWM, po wstępnym treningu, zwierzęta miały za zadanie znaleźć ukrytą platformę, a czas opóźnienia został zarejestrowany. Wyniki pokazały, że myszy poddane działaniu LPS spędzały więcej czasu w docelowym kwadrancie, podczas gdy myszy leczone LPS+Amb potrzebowały mniej czasu, aby dotrzeć do docelowego kwadrantu, gdzie umieszczono ukrytą platformę. Wszystkie te wyniki pokazały, że leczenie ambroxolem poprawiło zaburzenia uczenia się i pamięci w modelu zwierzęcym poddanym działaniu LPS.

Jakie procesy molekularne stoją za neuroinflammacją?

Neuroinflammacja może być opisana jako odpowiedź zapalna OUN na różne czynniki endogenne i egzogenne, które działają przeciwko homeostazie. Różne typy komórek w OUN reagują na te czynniki, takie jak astrocyty i mikroglej. Zaobserwowano, że neuroinflammacja wraz ze stresem oksydacyjnym są fundamentalnymi aspektami, które należy wziąć pod uwagę w odniesieniu do początku i postępu zaburzeń neurodegeneracyjnych. Neuroinflammacja jest aktywnie zaangażowana w choroby i zaburzenia neurologiczne, takie jak AD i PD. Jest to bardzo złożona odpowiedź obejmująca szereg zmian komórkowych i molekularnych, rekrutację obwodowych komórek odpornościowych, indukcję niektórych wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych i uwalnianie mediatorów zapalnych na poziomie mózgu.

W prezentowanym badaniu zbadano neuroprotekcyjny mechanizm ambroxolu w modelu mysim LPS, który sugerował, że ambroxol hamował podwyższoną neuroinflammację i indukowane stresem oksydacyjnym upośledzenie pamięci oraz dysfunkcje synaptyczne. Zgłoszono, że LPS wyzwala odpowiedź immunologiczną i zapalenie poprzez aktywację receptorów powierzchniowych TLR4. Wyzwala układ odpornościowy i stymuluje proces zapalny w mózgu. Kilka linii badań wykazało, że wywołane przez LPS komórki glejowe i makrofagi przyczyniają się do syntezy i uwalniania mediatorów zapalnych, a następnie generowania reaktywnych form tlenu. W rezultacie dochodzi do modyfikacji białek, zmiany funkcji komórek i nasilonej ogólnoustrojowej odpowiedzi zapalnej.

Podobnie w obecnym badaniu zaobserwowano, że LPS wywołuje odpowiedzi zapalne i podwyższony stres oksydacyjny, który dalej wykazuje szkodliwe efekty na komórki neuronalne. Endotoksyna, integralna część ściany komórkowej bakterii, jest izolowana i znana jako LPS i wstrzykiwana myszom. Aktywacja TLR4 przez podanie LPS prowadzi do fosforylacji NF-kB i zwiększa ekspresję biomarkerów zapalnych. Wcześniej zbadano, że ekspozycja na LPS znacząco aktywuje komórki glejowe (astrocyty i mikroglej) w sposób zależny od TLR4. Zastosowanie naturalnych substancji bioaktywnych jest głównym zainteresowaniem w zapobieganiu i leczeniu chorób neurodegeneracyjnych. Ambroxol jest jednym z nich, który znacząco zmniejszył aktywowaną gliozę poprzez supresję TLR4. W badaniu zbadano również, że LPS aktywował gliozę i znacząco zwiększał GFAP i Iba-1, co było podwyższone przez leczenie ambroxolem w korze i hipokampie mysiego mózgu. Podobnie, zwiększone poziomy fosforylowanego JNK (p-JNK), fosforylowanego NF-κB (p-NFκB) i innych mediatorów zapalnych, takich jak czynnik martwicy nowotworu alfa (TNF-α) i IL-1β, były obserwowane w korze i hipokampie mózgów myszy traktowanych LPS. Tymczasem poziomy ekspresji tych biomarkerów zapalnych były znacząco zmniejszone w grupie myszy traktowanych LPS i Amb.

Wcześniejsze badania wykazały, że hamowanie TLR4 może zmniejszyć ekspresję i produkcję IL-1β i TNF-α w komórkach mikrogleju traktowanych LPS. Co istotne, nasze wyniki Western blot i mikroskopii konfokalnej również wykazały, że leczenie ambroxolem znacząco zmniejszyło poziom ekspresji TLR4 w korze i hipokampie dorosłego mysiego mózgu.

Czy ambroxol oferuje kompleksową ochronę neuronalną?

Stres oksydacyjny jest innym parametrem i uważany jest za główne wydarzenie w chorobach neurodegeneracyjnych, stwardnieniu rozsianym i marskości wątroby. Inne badania sugerowały, że istnieje czynnik transkrypcyjny, który reguluje stres oksydacyjny, taki jak Nrf2. Jako czynnik transkrypcyjny, Nrf2 jest zaangażowany w regulację innych genów antyoksydacyjnych, takich jak HO-1. Ponadto, LPS jest odpowiedzialny za indukowanie stresu oksydacyjnego, który zmniejsza ekspresję antyoksydacyjnego białka HO-1 poprzez ingerencję w szlak sygnałowy Nrf2. Co istotne, nasze wyniki Western blot i immunofluorescencji ujawniły, że poziomy Nrf2 i HO-1 były znacząco obniżone w grupie poddanej działaniu LPS. Co ciekawe, w grupach współleczonych LPS + Amb, te podwyższenia były wyraźnie odwrócone, pokazując możliwe antyoksydacyjne efekty ambroxolu. Antyoksydanty, takie jak peroksydaza glutationowa, katalaza i dysmutaza ponadtlenkowa, również wykazywały niższe poziomy po leczeniu LPS. Dodatkowo, nasze obecne badanie ustaliło, że po wstrzyknięciu LPS nastąpiło znaczne zmniejszenie poziomów SOD w tkance korowej mózgu i hipokampie, podczas gdy leczenie ambroxolem znacząco zwiększyło poziom SOD. Ponadto, LPO w postaci MDA powoduje ekstremalny stres w komórkach neuronalnych, który był znacząco podwyższony w grupie LPS w stosunku do grupy kontrolnej. Znaczące zmniejszenie poziomów MDA podkreśliło ochronną zdolność ambroxolu i podkreśliło jego skuteczną rolę w zmniejszaniu stresu oksydacyjnego.

Synapsy odgrywają kluczową rolę w komunikacji neuronalnej. Wszelkie nieprawidłowości lub deformacje strukturalne spowodowane stresem endogennym lub egzogennym mogą prowadzić do stanów neurologicznych, takich jak AD i PD. Białka synaptyczne są odpowiedzialne za egzocytozę i endocytozę różnych neuroprzekaźników i stwierdzono, że są zmienione w zaburzeniach neurodegeneracyjnych. Dysfunkcja synaptyczna jest wspólną cechą demencji, obejmującą zarówno specyficzne białka presynaptyczne, jak i postsynaptyczne, które są białkiem gęstości postsynaptycznej (PSD-95) i białkiem związanym z synaptosomem 23 (SNAP-23). Wcześniejsze badania wykazały, że LPS obniża poziomy ekspresji SNAP-23 i PSD-95, białek synaptycznych, które są ważne dla funkcji poznawczych i plastyczności synaptycznej. Obecne dane pokazały, że iniekcja IP LPS znacząco obniżyła poziomy PSD-95 i SNAP-23; jednak podanie ambroxolu zauważalnie odwróciło spadek w synapsach i zwiększyło poziomy tych białek. Podobnie, z badania behawioralnego zbadaliśmy, że leczenie ambroxolem znacząco zmniejsza czas latencji u myszy traktowanych LPS, a także zwiększa czas spędzony w docelowym kwadrancie i liczbę przejść przez platformę podczas testu próbnego MWM. Dodatkowo, podczas testu labiryntu Y stwierdziliśmy, że leczenie ambroxolem zwiększyło % spontanicznego zachowania alternatywnego. Łącznie, wyniki MWM i labiryntu Y dostarczają dowodów, że ambroxol poprawił upośledzenia pamięci i uczenie się przestrzenne u myszy traktowanych LPS.

Podsumowując, ambroxol łagodzi neuroinflammację indukowaną LPS poprzez szlak TLR4/NF-κB i redukuje stres oksydacyjny poprzez regulację Nrf2/HO-1 u samców myszy C57BL/6N. Aktualne dane silnie wskazują na dobry profil bezpieczeństwa i obiecującego nowego kandydata do leczenia zaburzeń neurodegeneracyjnych. Łącznie wyniki ujawniają, że ambroxol może być uważany za doskonały lek terapeutyczny w zaburzeniach pamięci i neurodegeneracji indukowanych LPS.

Podsumowanie

Badania wykazały, że ambroxol skutecznie przeciwdziała procesom neurodegeneracyjnym poprzez hamowanie neuroinflammacji i stresu oksydacyjnego. Substancja ta reguluje ekspresję TLR4 oraz komórek glejowych, zmniejszając poziom cytokin prozapalnych TNF-α i IL-1β. Ambroxol wykazuje działanie neuroprotekcyjne poprzez modulację szlaku Nrf2/HO-1, zwiększając aktywność antyoksydacyjną i redukując stres oksydacyjny w tkankach mózgowych. Badania na modelach zwierzęcych potwierdziły, że ambroxol poprawia funkcje synaptyczne poprzez regulację białek SNAP-23 i PSD-95, a także znacząco poprawia funkcje poznawcze i pamięć przestrzenną. Wyniki wskazują na potencjał terapeutyczny ambroxolu w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera i Parkinsona, ze względu na jego kompleksowe działanie przeciwzapalne i neuroprotekcyjne.

Bibliografia

Ullah Safi, Park Tae Ju, Park Jun Sung, Atiq Abubakar, Ali Jawad, Kang Min Hwa, Ali Waqar, Choe Kyonghwan and Kim Myeong Ok. Ambroxol attenuates detrimental effect of LPS-induced glia-mediated neuroinflammation, oxidative stress, and cognitive dysfunction in mice brain. Frontiers in Immunology 2025, 16, 206-42. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2025.1494114.